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如何正确选择流式参数A，H，W

发布时间：2022-07-08

一、流式细胞仪上的A、H、W信号分别是什么？如何正确选择流式参数A, H, W?

流式细胞仪是免疫学研究的重要检测仪器，仪器价值高，检测参数多，初学者不易掌握。本文主要探讨流式检测中经常忽视并且容易混淆的流式参数A, H, W。流式细胞仪检测信号时，每一个细胞通过激光，仪器都会检测到一个光信号，由PMT（光电倍增管）放大将光信号转换成电脉冲信号，从细胞进入检测点，到细胞离开检测点，电脉冲信号由0到达峰值，再降为0，被记录成一个峰值， H是电脉冲信号的高度（H, height），代表脉冲信号的峰值，W是脉冲信号的宽度（W, width），指细胞通过激光检测区域的时间，H和W是直接检测出来的，A指的电脉冲信号的面积（A, area），是经过仪器设置计算处理的。由于A是通过W和H的数值计算出来的，在仪器上分辨率会更高。

图1：流式参数A, H, W产生过程

二、流式细胞仪上的A、H、W信号的用途

1. 去除黏连体

通常我们会选择这三个信号中的两个，用来分析数据时去除黏连体，排除干扰，黏连的细胞通过检测区域的时间更长，脉冲面积也更大。如图2所示，使用FSC-A和FSC-H来去除黏连体，对角线位置上的是单细胞（2倍体和4倍体通过激光检测口时，H和A是成正比增大的，两者之间应该是呈45度角分布；而粘连体通过时，H不变，A增大），红色虚线框内面积更大的是黏连体。若用FSC-A或者FSC-H与FSC-W组合来去除黏连体时，黏连体通过FSC-W较小的一群细胞来分析（图3）。流式细胞仪采集或细胞分选单细胞数据时，黏连体不能用于分析或分选，因为他们无法确定每个荧光标记的真实状态。如果黏连体太多，除了对实验结果产生影响，还会造成仪器管路的堵塞。在进行细胞周期分析时，黏连体会默认为分裂的细胞，若在分析时不去除，会导致G2M期细胞比例上升，影响检测结果的准确性。

图2：FSC-A和FSC-H去除黏连体

图3：FSC-W和FSC-H去除黏连体

2. 荧光信号的A, H, W

除了FSC，其他每一个通道（荧光通道）都有这三个参数可以记录。那么，在进行数据分析时应该选择荧光通道的哪个参数呢？由于荧光信号的面积（A）是采用对荧光光通量进行积分测量，通常反映的是细胞荧光的总和，荧光信号的高度（H）取决于每个细胞荧光的表达量，通常反映的是细胞单位面积上的荧光浓度，荧光信号的宽度（W）取决于细胞的大�。赴酱螅赴üす饧觳馇虻氖奔湓匠ぃ杂Φ挠庑藕趴矶仍酱螅捎谟庑藕诺目矶榷杂庑藕诺慕峁徊苯佑跋欤虼艘话阍诹魇较赴巧嫌庑藕拍现皇占擞庑藕诺母叨龋℉）和面积（A），通常荧光信号的面积（A）要比荧光信号的宽度（H）高一些(如图4所示)。临床和科研中使用A的时候比较多，特别在DNA多倍体测定时一定要使用A（这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA 的含量，当形状差异较大，而 DNA 含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的，而经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等），此外做荧光分辨率、荧光灵敏度等性能测试时也使用A。不过临床应用中的一些实验也显示，使用H时对于弱荧光细胞的辨识是有优势的，因此选用H也是可以的。通常情况下可以用其中的任何一个，根据实验要求来作图，仪器软件就会根据设置显示出最终的图形了。但是要注意的是如果做双色分析的A和H 的选择要一致。

图4PE荧光信号分别用H和A显示

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一、流式细胞仪上的A、H、W信号分别是什么？如何正确选择流式参数A, H, W?

二、流式细胞仪上的A、H、W信号的用途

一、流式细胞仪上的A、H、W信号分别是什么？如何正确选择流式参数A, H, W?

二、流式细胞仪上的A、H、W信号的用途